无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞 的影响

2021-02-03 10:32:51      点击:

摘 要:本试验旨在研究无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞的影响。试验选取遗传背景相似的初生健康乳猪 120 头,随 机分为试验组和对照组,每组 6 个重复,每个重复 10 头猪。对照组饲喂含抗生素的基础饲粮,试验组饲喂以 10% 发酵饲粮代替部分 无抗生素基础饲粮的试验饲粮,营养和能量水平调到与对照组相当。结果表明:1)试验组和对照组在小肠黏膜形态上有一定的差异。 2)在 44日龄时,试验组空肠绒毛高度比对照组提高 7.19%(P <0.05)。在 44和 75日龄时,试验组回肠绒毛高度显著高于对照组( P < 0.05)。 3)对照组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均高于试验组,但差异不显著(P > 0.05)。4)在 44 日龄时,试验组回肠 绒毛高度 / 隐窝深度(V/C)比对照组提高 17.18%(P < 0.01)。5)在 44 日龄时,对照组十二指肠、空肠和回肠黏膜上皮间杯状细 胞数量极显著高于试验组(P < 0.01)。在 75 日龄时,对照组十二指肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组(P < 0.01)。 综上所述,无抗发酵饲粮能改善小肠黏膜形态,增大吸收面积,从而促进小肠对营养物质的吸收。 

关键词:无抗发酵饲粮;猪;小肠黏膜;杯状细胞

抗生素在饲粮中的广泛使用,造成细菌耐药性、食品安全、 公共卫生和环境污染等问题,农业部农办医 [2018]13 号明确指 出 2020 年药物饲料添加剂全部退出,饲粮中禁止添加抗生素。 因此,研发安全、无残留、能有效替代抗生素的新型饲料添加 剂已成为发展趋势。由于益生菌发酵饲粮通过 1 种或多种益生 菌的发酵,饲粮中富含更多的活性益生菌菌体、有益代谢产物, 同时可消除饲粮中的抗营养因子,能够促生长和维持动物健康, 而益生菌是替代抗生素潜力最大的一种添加剂。在动物机体中, 小肠是营养物质消化吸收的主要场所,小肠黏膜状态与营养物 质的吸收密切相关,肠道杯状细胞是一种分泌细胞,其分泌的 黏蛋白(MUC)和三叶肽因子等形成肠道黏液层,对维持肠道黏 膜稳态起着重要的作用。本试验通过观察不同日龄猪的肠道黏 膜形态,测量小肠黏膜的绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度 / 隐窝深度(V/C)及肠绒毛上皮间杯状细胞的数量,来探讨无抗发 酵饲粮对猪肠道黏膜的影响,为其代替市场上含有抗生素的饲 粮提供理论依据。

1 材料与方法 

1.1 试验动物及设计 

选取 120 头体重相近的 “长 × 大”初生健康乳猪,随机 分为试验组和对照组,每组 6 个重复,每个重复 10 头猪,试验 分为 3 个阶段即哺乳阶段(0 ~ 28 日龄)、断奶阶段(29 ~ 44 日龄)、保育阶段(45 ~ 75 日龄),试验周期共 75d。各组试 验仔猪以窝为单位,7 ~ 28 日龄饲喂哺乳仔猪饲粮,29 日龄转 群至保育舍,饲喂断奶仔猪饲粮至试验结束。对照组和试验组 同舍饲养,各重复室内均匀分布,条件尽可能一致,自由采食,自主饮水。 

1.2 试验饲粮 

无抗发酵饲粮的生产方式为:将玉米与豆粕按各 50% 的比 例进行称量、粉碎和混合,作为发酵底物;发酵菌种由鼠李糖 乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌 组成,料水比为 1.00 ∶ 0.45;35℃ 厌氧发酵 60h,委托新乡市酵守康饲料有限公司生产。试验组饲粮加入以 10% 发酵饲粮来 替代部分不含抗生素基础饲粮,对照组饲喂含抗生素的基础饲 粮 (50mg/kg 金霉素和 100mg/kg 吉他霉素),并调整试验组各 阶段的饲粮营养水平与对照组相同。玉米-豆粕型混合饲粮发 酵前后营养水平见表 1。哺乳仔猪和断奶仔猪基础饲粮组成及 营养水平分别见表 2、表 3。

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1.3 样品采集与处理 

在仔猪出生后的第 5、15、25、44 和 75 分别于 2 组的每个 重复中随机抽取 1 头猪称重后宰杀,取十二指肠、空肠和回肠 各段约 2cm,于 4% 多聚甲醛液中固定。 

1.4 组织切片制作 

样品在 4% 多聚甲醛溶液中固定 48h 后,将组织修整成 7mm 小块;自来水冲洗固定 12h;常规梯度酒精脱水、透明、石蜡 包埋后切片,进行苏木精-伊红(HE)染色和高碘酸雪夫氏(PAS)染色。 

1.5 肠黏膜检测指标 

各阶段的十二指肠、空肠和回肠每个样本中选取 5 张切 片,低倍镜下每张切片选出 5 个不同视野观察肠黏膜形态,测 量绒毛高度、隐窝深度、V/C 和杯状细胞数量。观察过程中应 注意所选取的肠绒毛长度应该基本一致,应用 Nikon50i 显微镜 照相处理软件进行拍照。

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1.6 统计分析 

试验数据用平均值 ± 标准差表示,采用 SPSS 19.0 软件进 行 t 检验分析,以P < 0.05 表示差异显著,以P < 0.01 表示 差异极显著。

2 结果与分析 

2.1 无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态的影响 

试验组和对照组小肠黏膜形态变化上有一定的差异。由图 1 可见,2 组十二指肠不同的变化表现为:试验组肠绒毛较长, 呈明显的叶状结构,绒毛的游离端明显膨大。绒毛体至腺体部 散在少量杯状细胞,肠腺中的杯状细胞增多。肠绒毛的固有层 中有较多散在的淋巴细胞。而对照组肠绒毛较短,呈指状,绒 毛的游离缘有较多的杯状细胞分散在柱状细胞之间。2 组猪空 肠不同的变化表现为:试验组肠绒毛较粗,固有层发达,其中 弥散大量淋巴细胞,肠腺部的固有层也有大量淋巴细胞,形成 淋巴组织样结构。对照组肠绒毛较细,固有层不发达,肠腺部 固有层内淋巴细胞较少,呈散在状,没有形成淋巴组织样结构。 2 组回肠不同的变化表现为:试验组回肠绒毛较稀疏,绒毛的 固有层较发达,其中分布大量淋巴细胞。肠腺基部的固有层中 有大量淋巴细胞集聚,并突破黏膜肌层,在固有层和黏膜下层 形成集合淋巴小结样构造。对照组回肠绒毛细长,数量较多, 排列较密。 在黏膜下层中见有淋巴小结形成,呈现孤立淋巴小 结样构造。 

2.2 无抗发酵饲粮对猪小肠绒毛高度的影响

如表 4 所示,自 25 日龄开始,试验组十二指肠绒毛高度整 体都略高于对照组,但没有达到差异显著的水平(P > 0.05)。 在 44 日龄时,试验组空肠绒毛高度比对照组提高 7.19 %(P < 0.05),其他日龄组间差异不显著(P > 0.05)。在 44 和 75 日龄时,试验组回肠绒毛高度显著高于对照组(P < 0.05), 其他日龄组间差异不显著(P > 0.05) 。 

2.3 无抗发酵饲粮对猪小肠隐窝深度的影响

 如表 5 所示,对照组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均较 高于试验组,但差异不显著(P > 0.05)。在 75 日龄时,试验 组十二指肠和回肠隐窝深度比对照组分别降低 6.40% 和 5.98%, 但差异不显著(P > 0.05) 。 

2.4 无抗发酵饲粮对猪小肠 V/C 的影响 

如表 6 所示,试验组十二指肠、空肠和回肠 V/C(除 15 日 龄十二指肠外)均高于对照组,但差异不显著(P > 0.05)。 其中在 44 日龄时,试验组回肠 V/C 比对照组提高 17.18%,差异 极显著(P < 0.01) 。

 2.5 无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜上皮间杯状细胞数量的 影响 

小肠黏膜上皮的杯状细胞分散在柱状细胞之间,但也有连 续排列的杯状细胞,一般靠近肠腺部位较为集中,胞核位于基 底部,呈高脚杯状,被 PAS 染色法染成深红色(图 2)。在 25 日龄时,试验组和对照组十二指肠绒毛体的中、下两侧部至肠 腺部见有较多的杯状细胞,绒毛顶端的杯状细胞较少,杯状细 胞分泌的黏液被染成深红色覆盖在肠上皮表面,以对照组较显 (图 2-A、图 2-B)。在 75 日龄时,试验组空肠肠绒毛变短, 但较粗,排列较密集。杯状细胞多分散于肠绒毛体两侧的吸收 细胞间,绒毛顶端少有杯状细胞(图 2-C)。对照组空肠绒毛较 粗大,呈叶状。 在绒毛两侧的吸收细胞之间杯状细胞数量增多, 有的呈连续排列,肠腺部杯状细胞较为集中(图 2-D)。在 75 日龄时,回肠绒毛变短,较粗,绒毛的固有层中有大量淋巴细胞,绒毛顶端有肠上皮脱落现象(图 2-E、图 2-F)。试验组肠 绒毛呈锥状,绒毛的两侧到肠腺部见有大量杯状细胞,肠腺腔 的上皮细胞也被 PAS 染成深红色(图 2-E)。对照组回肠绒毛呈 短柱状,较稀疏,绒毛的中、下部和肠腺部有较多的杯状细胞, 至绒毛顶端脱落(图 2-F)。

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如表 7 所示,在 44 日龄时,对照组十二指肠、空肠和回肠 黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组(P < 0.01)。在 75 日龄时,对照组十二指肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高 于试验组(P < 0.01)。其他日龄组间差异不显著(P > 0.05)。

3 讨 论 

小肠是猪对营养物质消化和吸收的主要场所,其功能的发 挥与其生理结构是密切相关的,肠道屏障功能可以维持微生态 的平衡,所以肠道黏膜与动物的健康至关重要,特别是小肠绒 毛高度、隐窝深度、V/C 及有效的吸收面积都是衡量其消化和 吸收功能高低的重要指标,肠道形态学结构的改变是造成消化 吸收功能和免疫功能差异的主要原因之一。肠绒毛和微绒毛的 存在极大地增加了小肠与食物的接触表面积,肠绒毛变短时, 肠上皮细胞数量随之减少,其营养物质吸收能力降低。绒毛根 部下陷至固有层形成的管形缩陷为小肠腺即隐窝,当肠道绒毛 脱落,隐窝多能干细胞会分化成新的肠上皮细胞向绒毛顶端移行,形成新的绒毛。隐窝深度反映细胞的生成率,隐窝变浅表 明细胞成熟率上升,分泌功能增强。V/C 下降表明小肠的消化 吸收功能下降,比值升高表明消化吸收率增强。庞敏等研究表 明,断奶应激对仔猪的肠道黏膜形态有很大的影响,而饲喂益 生菌发酵饲粮可以显著提高断奶仔猪的肠道上皮绒毛高度,且 显著提高 V/C。断奶应激会造成仔猪的绒毛萎缩,隐窝细胞分裂 过快,造成隐窝深度增加及 V/C 下降,严重影响小肠对营养物 质的消化吸收。益生菌发酵饲粮可以提高饲粮中有机酸含量, 降低 pH,进而使断奶仔猪胃液 pH 与消化道酸度发育水平趋于稳 定,减少仔猪腹泻和增强仔猪对营养物质的消化吸收能力。益 生菌发酵为减少断奶仔猪应激提供了一种营养策略。邓军研究 表明,同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌可以提高十二指 肠和空肠的绒毛高度和降低空肠和回肠的隐窝深度,V/C 升高。 Feng 等研究发现,饲喂发酵豆粕配合饲料可以显著提高断奶仔 猪小肠绒毛高度,提高 V/C。

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本试验结果显示,在 44 日龄时,试验组空肠和回肠绒毛高 度显著高于对照组;在 75 龄时,试验组回肠绒毛高度显著高于 对照组;在 44 日龄时,试验组回肠 V/C 显著高于对照组。根据 本试验结果得出:试验组绒毛高度、隐窝深度和 V/C 略优于对 照组。 其原因可能是饲粮经过益生菌发酵后,其营养成分更有 益于动物机体的吸收,几种益生菌复合发酵后随着饲粮一同进 入消化道,黏附于肠道黏膜上皮细胞,并在动物胃肠道中迅速 萌发和增殖,调节胃肠道微生物生态平衡,且发酵产物中的有 机酸、氨基酸和小肽等代谢产物能刺激肠绒毛的生长发育和肠 上皮细胞的更新,增加绒毛高度,提高 V/C,进而促进小肠对饲 粮中营养物质的消化吸收。此外,益生菌还能调节肠道黏液的 分泌,上调肠道上皮细胞紧密连接蛋白和细胞骨架蛋白的表达, 增强肠上皮细胞间的紧密连接,维持肠道黏膜屏障的完整性。 小肠杯状细胞起初分化于小肠腺,之后向绒毛顶端或肠上皮不 断迁移分化,最后脱落至肠腔死亡,为杯状细胞的一个分泌周期。 杯状细胞是一种典型的黏液细胞,其成分主要是黏蛋白,黏蛋 白颗粒分泌到胞外与水、无机盐等合成黏液附着在肠黏膜表面 形成肠道黏液层,有润滑保护作用,并参与多种肠道疾病的发 生发展。但肠绒毛杯状细胞数量增多,分泌过量的黏液覆盖在 肠黏膜表面,会使消化酶的分泌减少,肠黏膜的吸收面积减少, 再加之大量黏液被覆在肠上皮细胞的表面,在肠上皮细胞与肠 内容物之间形成了一道屏障,减少了肠上皮细胞与营养物质接 触的机会,故在很大程度上降低了肠道的吸收面积,导致营养 物质的吸收障碍,严重时可引起腹泻。张献彩发现发生糖尿病小鼠的小肠绒毛易被破坏,糖尿病组中杯状细胞的分泌物比同 月份正常对照组显著增加。本试验结果显示,在 44 日龄时,对 照组十二指肠、空肠和回肠杯状细胞数量极显著高于试验组; 在 75日龄时,对照组十二指肠杯状细胞数量极显著高于试验组。 分析原因可能是饲喂抗生素饲粮的对照组猪在断奶后,由于受 到断奶应激的影响,肠道黏膜受损,破坏小肠绒毛,引起炎症 反应,使缓激肽和组织胺释放增多,这些刺激可直接引起杯状 细胞分泌增多,而无抗发酵饲粮中的益生菌能与黏蛋白一起作 为肠道黏膜屏障,阻碍致病菌进入体内,并能调节杯状细胞的 产生和肠液中黏蛋白的含量,使肠道中杯状细胞的数量趋于稳 定,维持肠道结构的完整。此外,发酵产物中的一些小分子有 益代谢产物能自由通过黏液层,更有利于机体的吸收。

4 结 论 

综上所述,饲喂无抗发酵饲粮在哺乳、断奶和保育阶段对 猪机体无不良影响,并可在一定程度上改善肠道黏膜形态,提 示无抗发酵饲粮可以替代含抗生素的饲粮应用于猪生产中。 

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